Sie ist die „Bergmannskirche“ der Eisleber Neustadt. An die Kirche schloss sich das 1515 gegründete Augustiner-Eremiten-Kloster mit seinen fünf schönen altfränkischen Mönchskammergiebeln an. Als Distriktsvikar des Augustinerordens hielt sich Luther mehrmals dort auf. Die St.-Annen-Kirche war die erste evangelische Kirche des Mansfelder Landes.
Eine europäische Besonderheit ist die „Eisleber Steinbilderbibel”, die von Hans Thon Uttendrup aus Münster 1585 geschaffen wurde. Sie besteht aus 29 Sandstein-Relieftafeln und zeigt hauptsächlich Bilder aus dem Alten Testament.
Die Kanzel aus dem Jahre 1608 ist aus Gipsstuck. Kanzelträger ist der gehörnte Mose. Dargestellt sind die Menschheitsgeschichte und die Lebensgeschichte Jesu. Die Glasmalereien der kostbaren Fenster lassen fränkische Einflüsse erkennen.